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FÄRBEANWEISUNG
FÜR DIE
Labeled-Streptavidin-Biotin-Methode (LSAB)
mit dem automatischen Immunstainer TechMate von DAKO
Stand: 21.01.99
BR =
Brutschrank
RT = Raumtemperatur
AK = Antikörper
WB = Wasserbad
1.
Paraffinschnitte nach dem Schneiden noch mindestens eine Stunde auf
der Wärmeplatte liegen lassen.
2. Schnitte über Nacht in den Brutschrank stellen bei 37°C.
3. Schnitte in vorgewärmtem (37°C) Xylol
entparaffinieren ------------------> 30 min.
! In dieser Zeit AK-Verdünnungen ansetzen (BR)
4. absteigende
Alkoholreihe -----------------------------------------------------------> aqua dest
5. Kochen in vorgewärmten (95°C) TRS-Puffer -----------------------------------> 30 min.
im Wasserbad (WB)
bei
95°C
TRS-Gebrauchspuffer
kann 5 mal verwendet werden
90 ml
Target Retrieval Solution (S 1699 / 10
fach konzentriert)
+
810 ml aqua dest
pH-Wert auf 6,1 einstellen
6.
Behälter mit den Schnitten aus dem Wasserbad nehmen
---------------> 20 min.
und abkühlen lassen.
bei
RT
7. Spülen
der Schnitte Spülen
der Schnitte in mehreren Chargen aqua
dest, bis kein Schäumen
mehr
beobachtet wird.
8. TechMate-
Immunstainer einschalten und gewünschtes Programm auswählen.
9. Saugkissen in das
Gerät legen (falls nicht schon am Tag zuvor gemacht)
10. Füllen Sie jetzt die
Reagenziengefäße mit den entsprechenden Lösungen:
Das
Reagenziengefäß hat 10 Vertiefungen ( einzufüllende
Flüssigkeitsmenge
je nach verwendeter Lösung siehe
Unterpunkte a-g ).
a. Puffer [1, 2, 3 und 4] ( Puffer Kit K 5006): 2ml
pro Vertiefung
Reagenziengefäße entsprechend der Anzahl der zu
färbenden Schnitte
mit dem
jeweiligen Puffer (1, 2, 3, oder 4) auffüllen.
b.
Protease K: 350 µl pro Vertiefung
4 ml
Proteinase K-Verdünnungsmedium (S 2032)
+
Achtung
: Da Sie bei einem
Programmdurchlauf fast immer gleichzeitig AK mit und ohne Proteinase Andauung haben
füllen Sie bei den AK denen keine Proteinase Andauung vorgeschaltet ist einfach 350µl
Puffer Nr. 2 in die jeweilige Vertiefung, damit diese Präparate zwischenzeitlich nicht
austrocknen.
c. Antikörper:
300 µl pro
Vertiefung
Die AK werden mit dem Antikörperverdünnungsmedium
(grüne Lösung) (S 2022)
verdünnt.
Detektionssystem (K 5005):
d. Multilink [gelbe Farbe]
= AB2:
300
µl pro Vertiefung
e. Label [rote Farbe] = AP (Alkalische Phosphatase):
300 µl pro Vertiefung
Räumen Sie die Objektträger in
das Färberack und starten Sie jetzt das Gerät
f. Chromogen:
550 µl (nicht weniger !) pro
Vertiefung
(Da das Chromogen
instabil ist darf es erst ca. 10 min. bevor die Schnitte damit inkubiert werden sollen
angesetzt und in den Stainer gestellt werden. Die anzusetzende Lösungsmenge richtet sich
nach der Anzahl der Proben und daraus resultierend aus der Menge der benötigten
Reagenziengefäße.
Siehe
nachstehende Tabelle: Da
alle beim Ansetzen des Chromogens benötigten Lösungen Zimmertemperatur haben müssen
nimmt man diese gleich morgens aus dem Kühlschrank.
g. Hämatoxilin:
350µl pro Vertiefung
Nach
Ablauf des Programmes nehmen Sie die Schnitte aus dem Färberack führen Sie durch eine
aufsteigende Alkoholreihe -->(70 % Alkohol --> 2 min., 96 % Alkohol --> 5 min.,
100% Alkohol --> 10 min.) ---> Xylol ---> Eindecken mit Pertex.
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letzte
Aktualisierung
18.01.2008 18:29
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